ELISA常见问题及处理对策

ELISA因其敏感性高、特异性强等特点，被广泛用于临床或科研中抗原和抗体的检测。ELISA 实验操作相对简单，但小实验蕴含大道理，细节稍不注意很容易产生假阳性或假阴性。接下来，博士德将以预实验的方式为大家演示ELISA具体实验操作过程。

1) 确认移液器是否校准

2) 确认各个仪器设备是否正常运行

3) 检查试剂盒各个组分和规格是否与说明书一致

1) 建议标准曲线和样本一起做

2) 样本可在不同组别中挑选具有代表性的样本

3) 预估样本含量，可采用1:1/1:10/1:100等稀释比做预实验，确定样本稀释比例

1) 推荐使用漩涡器

2) 反复颠倒混匀

3) 溶解后的标准品按说明书进行保存

1) 推荐使用排枪

2) 提高加样速度，避免板子干燥时间太长

3) 避免出现太多气泡

1) 严格按照说明温度和时间进行孵育

2) 避免板子叠加孵育

3) 每次都需要使用新的封板膜进行孵育，避免交叉污染

1) 推荐使用自动洗板机洗板

2) 人工洗板时，每次板孔尽量拍干

3) 每孔至少保证300ul洗液量

1) 建议采用四参数曲线对数据进行拟合

2) 曲线R值一般不低于两个9

3) 可使用拟合软件

可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液）、细胞培养上清、细胞、组织等均可作标本以测定其中某种成份。有些标本可直接进行测定，有些则需经预处理。

室温血液自然凝固 10-20 分钟后，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。

应根据试剂盒的要求选择 EDTA 、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，加入 10 ％（ v/v ）抗凝剂 ( 0.1M 柠檬酸钠或 1% heparin 或 2.0%EDTA.Na2) 混合 10-20 分钟后，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。如有沉淀形 成，应再次离心。

用无菌管收集。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。

检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。检测细胞内的 成份时，用 PBS （ PH7.2-7.4 ）稀释细胞悬液，细胞浓度达到 100 万 /ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

检测细胞的成份时，对于贴壁细胞，去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞10 秒后，细胞就会被裂解。对于悬浮细胞，离心收集细胞，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍.加入适量裂解液, 用枪吹打把细胞吹散。用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装然后再裂解。充分裂解后，10000-14000g离心3-5 分钟，取上清，即可进行后续操作。

切割标本后，称取重量。加入一定量的 PBS或组织蛋白萃取试剂，缓冲液中可加入蛋白酶抑制剂。用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清置于 -20 度或 - 70 度保存，如有必要，可以将样品浓缩干燥。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

ELISA试剂盒可检测低浓度的蛋白，检测能力可达到pg/mL，保证蛋白检测的准确性。

24个健康人的血清样本进行ELISA检测，利用Human IL-1 beta ELISA Kit（EK0392)检测24个正常人血清样本。

只检测目标分析物，每个试剂盒都经过广泛的相关分子的交叉反应测试，确保无交叉反应和干扰。

选择和HUMAN FOLR2 相关的蛋白，进行特异性分析，用远高于检测限的蛋白浓度进行测试分析。

不同批次的ELISA试剂盒在标准曲线上进行了重复性试验保证批间CV值小于10%。

三个不同浓度Mouse TNFα的样本（不同颜色线），用4个不同批次持续12个月检测。

通过回收实验测试确认试剂盒是否受干扰因子的影响。

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将高、中、低3个不同浓度的分析物加入到对应的样本(血清、血浆、细胞上清)中检测，并计算蛋白的回收率，回收率标准一般是80%-120%。

ELISA 试剂盒中的标准品并不是简单的质量定量，不同厂家使用的标定方法也各种差异。博士德参考了 WHO 国际标准，并进行了校正。