推广 热搜: pe50  试剂  pe10  大鼠胆管插管  插管  实验室  胆汁  小鼠颈静脉插管  大鼠  对羟基肉桂酸 

ELISA检测过程中的常见问题及解决方案

   2024-03-20 2330
核心提示:ELISA检测过程中的常见问题及解决方案
 ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assays,ELISA) 即酶联免疫吸附实验,是目前广泛应用于各种抗原抗体检测的方法,主要有灵敏度高和特异性强的特点。ELISA操作步骤看似简单,整个测定过程中却有诸多影响因素,导致检测结果可能与实际结果偏差较大。最常出现的问题包括显色淡,灵敏度偏低、重复性不佳等。

为帮助大家分析实验中常见问题,我们将ELISA实验中常见问题和解决方案归纳总结如下,供临床检测中参考。

 

常见问题1:显色淡,灵敏度偏低,阳性对照值偏低

序号 可能原因 解决方案
1 试剂盒未平衡至室温 实验前试剂盒应置于室温平衡至少30分钟,以确保所有试剂均已平衡至室温
2 温育温度不足37℃ 应注意培养箱温度,放入反应板后尽量减少开启次数以免影响温度恒定
3 温育时间不够 校正定时钟准确定时
4 样品或酶结合物加样量偏少 校准移液器;注意使枪头与移液器接合紧密,移液时不宜过快,排放完全
5 洗涤时冲击力太大、浸泡时间过长、洗涤次数增加,底物作用时间不够 严格按照说明书操作
6 样品用NaN3防腐剂,抑制了酶的活性 与酶一同加入的样品中不能用NaN3防腐
7 蒸馏水被污染、水质有问题 使用新鲜合格的蒸馏水
8 洗液配制不当 准确稀释浓缩洗涤液
9 试剂盒在运输途中时间太长 夏天长途运输时应放足够冰袋并尽可能缩短运输时间
10 试剂盒超过有效期 过期试剂不可以使用
11 不同批号试剂混用 不同批号试剂不能混用

常见问题2:高背景,阴性对照值偏高,假阳性

序号 可能原因 解决方案
1 阴性对照被阳性对照或样品污染 洗涤时勿将洗液溢出孔外
2 温育时间过长,导致非特异性结合 校正定时钟准确定时
3 加样量过多 严格按照说明书操作,加液量、稀释要准确
4 温育温度过高 应注意培养箱温度是否正确、恒定
5 加显色剂后在温育时受强光或紫外线照射 应保存在暗处,避光
6 读板前停留时间过长 加终止液后10分钟内测定结果

常见问题3:重复性差,两个复孔值相差太大

序号 可能原因 解决方案
1 样品数量多少不一,加样时间有长有短 重复某一样品时,加样时间尽可能与第一次接近
2 保温时间不一致,洗涤条件不一致,操作人员不一致 重复测定标本,操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致,以排除这些因素造成的不一致的可能性
3 加样量不一致 样品稀释前应充分混匀,尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴
4 不同批号试剂盒组分混用 不同批号试剂不能混用

常见问题4:满板白,阳性对照不显色

序号 可能原因 解决方案
1 把终止液误当作酶结合物或底物使用 严格按说明书操作,加液时看准标签,换用合格的蒸馏水或去离子水,选用洁净量筒,正确稀释洗涤液,不要漏加试剂
2 漏加或错加试剂,如酶结合物、底物A、B液
3 蒸馏水、配制洗涤液的量筒或盛洗涤液的瓶子受酶抑制物污染

常见问题5:满板显色

序号 可能原因 解决方案
1 读板前停留时间过长 加终止液后10分钟内测定结果
2 加显色剂后在温育时受强光或紫外线照射 应保存在暗处,避光
3 温育时间过长,导致非特异性结合 校正定时钟准确定时
4 温育温度过高 应注意培养箱温度是否正确、恒定
5 加样量过多 严格按照说明书操作,加液量、稀释要准确
6 样品放置时间过长,样品染菌 样品可长期保存于-20℃,防止污染
7 洗涤不充分,反应孔中有酶残留 应充分洗涤
8 蒸馏水被污染 使用新鲜合格的蒸馏水
9 温育时未贴封板膜,使样品或酶标试剂蒸发,吸附于孔壁难以清洗 温育时应贴封板膜或加盖

优质的试剂,良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。一些细节操作不当就会对试验结果造成很大偏差,因此我们在实验中应注意以下事项:

1. 加样:

不规范的移液操作可能带来0.1%到5%的移液误差,甚至更高!

(1)移液器定期校准:选择密封性好质量可靠的吸头,吸量不准确,直接影响检测结果;

(2)加样前,溶液充分混匀,垂直悬空加入液体,避免加在孔壁上或产生气泡;

(3)加样时避免液体溅出,如有样本溅出,应用吸水纸轻轻拭干,并做相应记录;

(4)如果移液器漏气致使加样量不足,可先吸出(尽量吸净)后加入需求量,并做好相应记录,若结果在灰区,需要复核检测;

(5)每次加样顺序一致,尤其底物、终止液顺序一致,保证每个孔显色时间相同。

2. 试剂盒使用前室温平衡:

温度是ELISA结合反应的重要影响因素,为使所有样本在一致的温度下反应,实验前务必将所有的试剂平衡至室温,包括检测样本,避免因温度的动力学反应差异而导致ELISA检测结果的不准确。

3. 标准品的溶解与稀释,严格按说明书要求进行。

ELISA标准曲线是结果计算的尺子,标准品是ELISA实验成功与否的关键点。

(1)标准品短暂离心,让因运输沾到管盖、管壁的标准品沉到管底。

(2)根据说明书加入一定体积的蒸馏水(或说明书指定溶液),加水后轻柔涡旋震荡,室温静置混匀。

4. 标准品和样本做复孔

为了获得更准确的实验结果,标准品和样本进行复孔检测。

(1)计算平均值,确保实验结果更准确。

(2)解决实验中失误操作造成的跳孔现象。

(3)计算CV值,对实验的操作和试剂盒的精密度进行评估。

5. 温育

(1) 温育时,反应板均不宜叠放,以保证各板的温度都能迅速平衡。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。

(2) 根据说明书进行温育,并注意避光需求。在进行室温反应时,若环境温度与规定条件偏差较大,可使用恒温培养箱进行有效温育。

6. 洗涤

(1)手工洗板,拍板时要垂直,避免交叉污染,用力不能过猛致使液体返溅;

(2)机器洗板应经常检查冲洗头是否畅通,若被异物堵塞可用纤细针头挑出。并注意维护保养,每天使用后用纯化水或去离子水冲洗管路,保持管路洁净。

(3)洗涤后反应板尽量扣干;扣干使用的吸水材料应为无尘材质,避免污染反应孔;扣干后的反应板立即加液,不能干板太久影响反应。

7. 检测

(1)酶标仪使用前务必预热10~15分钟,使结果更稳定。

(2)长时间高湿度容易损坏酶标仪滤光片,长时间不用酶标仪时,需要定期开机维护,以保证设备性能正常。酶标仪每年均需定期校验,保证测定结果准确。

(3)根据说明书要求在规定波长条件下使用酶标仪进行结果读取。有些说明书规定双波长测定,该方法可以最大限度的消除指纹、杂质及不透光的物质对酶标仪读数带来的误差,以保证实验数据的准确度。

(4)TMB是ELISA检测中常用的底物,经HRP作用后显蓝色,经酸终止后,TMB产物由蓝色呈黄色,可在比色计中定量,最适吸收波长为450nm。

 
反对 0举报 0 收藏 0 打赏 0评论 0
 
更多>同类资讯
推荐图文
推荐资讯
点击排行
网站首页  |  会员服务  |  版权隐私  |  使用协议  |  联系方式  |  关于我们  |  网站地图  |  排名推广  |  广告服务  |  积分换礼  |  网站留言  |  RSS订阅  |  违规举报  |  苏ICP备19018185号  |  苏公网安备 32011502010128号
Powered By DESTOON