非洲猪瘟（Africanswinefever，ASF）由非洲猪瘟病毒（Africanswinefevervirus，ASFV）引起的一种猪的急性、热性、高度传染性疾病。临床表现为高热、全身出血、脾脏异常 肿大、呼吸障碍和神经症状，死亡率可达100%。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须通报的疫病。
2、用途：
该试剂盒用于ASFV的核酸检测，有助于对ASF的实验室诊断、监测和流行病调查。
3、原理：
本试剂盒采用Taqman探针实时荧光聚合酶链式反应(RealtimePCR)，对ASFV核酸进行定性或半定量检测。
4、组分：
|
试剂名称 |
数量 |
|
样本处理液 |
5ml×1管 |
|
ASF PCR反应液 |
1100µl×1管 |
|
ASF阴性对照 |
100µl×1管 |
|
ASF阳性对照 |
100µl×1管 |
样本处理液2-8℃避光保存12个月；其它试剂-20℃避光保存12个月。
7、样品收集和储存：
1.推荐选择抗凝血、血清、组织等样本，无菌采样并立即送往实验室进行检测。
2.样品短期可在4℃冷藏保存，较长时间保存应在-20℃或者-70℃，并且避免反复冻融。
8、操作步骤：
1.样本处理
（1）血液样本：
血液样品无需处理。
（2）组织样本：
分别从猪肉组织、淋巴结、脾脏不同位置取样，用手术剪剪碎混匀后取 0.1g 于研磨器中研磨，加入 1.5ml 生理盐水继续研磨，待匀浆后转至 1.5ml 无菌离心管，4000 r/min 离心 2 分钟，取上清 备用。
2.样本核酸提取
根据待检样品数量，准备无菌 1.5ml 离心管，每管加入 90μl 样本处理液。
每管分别加入已处理的待检样品 10μl，充分混匀，室温放置 2 分钟。
4000 r/min 离心 1 分钟，上清即为模板 DNA。
3.加样
在配套 PCR 管中加入20μlPCR反应液，将制备好的模板 DNA，阴性对照，阳性对照各取 5µl分别加入对应反应管中，加完后盖紧PCR反应管盖，置于PCR仪上。
4.荧光PCR扩增与信号收集
|
循环数 |
温度（℃） |
时间 |
数据收集位点 |
|
1 |
94 |
2min |
- |
|
40 |
94 |
5s |
- |
|
60 |
15s |
数据收集 |
注：报告基团选FAM,淬灭基团选NONE。
9、结果成立条件：
阳性对照：CT值＜32并有明显的扩增曲线。
阴性对照：无CT值或者CT值>38，线性为直线或者轻微斜线，无明显扩增曲线。
以上要求需同时满足，否则本次实验无效，需要重新进行。
10、结果判定：
|
CT值 |
样本检测结果 |
|
≤36并有明显的扩增曲线 |
阳性，样本中检测出ASFV核酸。 |
|
>36有明显的扩增曲线 |
可疑，需重复检测。若第二次检测CT值仍>36，并有明显扩增曲线则判定为阳性，否则为阴性。 |
|
无CT值，或者CT值>36并无明显的扩增曲线 |
阴性，样本中未检测出ASFV核酸。 |
注意事项：
1.所有实验过程应遵守农业农村部关于非洲猪瘟病毒检测相关的规定。
2.反应体系应在特定配液区或者超净工作台中配制，整个实验过程严格控制污染。
3.PCR整个试验分配液区、模板提取区、扩增区。流程顺序为配液区→模板提取区→扩增区。严禁器材和试剂倒流。
4.反复冻融试剂将减低检测灵敏度，本试剂盒应在5次内用完.
5.-20℃保存的各试剂管使用前应在室温下完全融化，液体融化后需彻底混匀，2000rpm离心15s，使用后立即放回-20℃。
6.在DNA提取过程中，避免核酸酶污染，尽量缩短操作时间。
7.注意防止试剂盒组分受污染。不要使用超过有效期限的试剂，试剂盒之间的成分不要混用。
8.PCR反应管避免气泡存在，管盖需盖紧。
9.不同批次的试剂盒勿混用。
